一、液相色譜理論(lun)發(fa)展簡(jian)況

　　色譜法(fa)的(de)分離(li)原理是：溶于流(liu)動相(xiang)(xiang)( phase)中(zhong)的(de)各組分經過固定(ding)相(xiang)(xiang)時(shi)，由(you)于與固定(ding)相(xiang)(xiang)(stationary phase)發生(sheng)作用(吸附、分配、離(li)子吸引、排(pai)阻、親和)的(de)大(da)小、強弱不同，在固定(ding)相(xiang)(xiang)中(zhong)滯留時(shi)間不同，從而先后從固定(ding)相(xiang)(xiang)中(zhong)流(liu)出。又(you)稱為色層法(fa)、層析法(fa)。

　　色(se)譜(pu)(pu)(pu)法zui早是由俄國植(zhi)物(wu)學家茨維特(Tswett)在(zai)1906年研究用碳酸鈣(gai)分離(li)植(zhi)物(wu)色(se)素時(shi)發(fa)現的，色(se)譜(pu)(pu)(pu)法(Chromatography)因(yin)之(zhi)得(de)名。后來在(zai)此(ci)基礎上發(fa)展出(chu)紙色(se)譜(pu)(pu)(pu)法、薄層(ceng)色(se)譜(pu)(pu)(pu)法、氣相色(se)譜(pu)(pu)(pu)法、液相色(se)譜(pu)(pu)(pu)法。

　　液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)開(kai)始(shi)階段是用(yong)大直徑的玻璃(li)管柱在室溫和(he)常壓(ya)(ya)下用(yong)液(ye)(ye)(ye)位差輸(shu)送流(liu)動相(xiang)(xiang)，稱(cheng)為經典液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)，此(ci)方法(fa)(fa)柱效低(di)、時間長(常有幾個小時)。液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)的基礎上，于60年代(dai)后期引(yin)入了氣相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)理論而迅速發展(zhan)起(qi)來的。它與經典液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)的區別是填料顆粒(li)小而均勻，小顆粒(li)具有高(gao)柱效，但會引(yin)起(qi)高(gao)阻(zu)力，需用(yong)高(gao)壓(ya)(ya)輸(shu)送流(liu)動相(xiang)(xiang)，故又稱(cheng)高(gao)壓(ya)(ya)液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱(cheng)為高(gao)速液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱(cheng)現代(dai)液(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)。

　　二(er)、HPLC的特點和(he)優點

　　HPLC有以(yi)下特點(dian)：

　　高壓—壓力可(ke)達150~300Kg/cm2。色譜柱每米(mi)降壓為75 Kg/cm2以上。

　　高速—流速為0.1~10.0 ml/min。

　　—可(ke)達5000塔板(ban)每(mei)米。在一根柱中同時分離成份(fen)可(ke)達100種。

　　高靈(ling)敏度—紫外(wai)檢測器靈(ling)敏度可達0.01ng。同時消(xiao)耗(hao)樣(yang)品(pin)少。

　　HPLC與(yu)經典液相(xiang)色譜相(xiang)比有以(yi)下優點：

　　速度(du)快—通常(chang)分析一個樣品(pin)在15~30 min，有些(xie)樣品(pin)甚至在5 min內(nei)即可完成。

　　分辨率(lv)高—可選擇(ze)固定相和流動相以達到*分離效(xiao)果。

　　靈敏(min)度高—紫外檢(jian)測器可達0.01ng，熒光和(he)電化學(xue)檢(jian)測器可達0.1pg。

　　柱子可反復使用—用一根色譜柱可分離(li)不(bu)同的化合物(wu)。

　　樣品量少，容易回收(shou)—樣品經過色譜柱后不被破(po)壞，可以收(shou)集單一組分(fen)或做制備。

　　三、色譜法分類

　　按兩相(xiang)(xiang)(xiang)的物(wu)理(li)狀態可分(fen)為(wei)(wei)：氣(qi)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法(GC)和(he)(he)液(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法(LC)。氣(qi)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法適用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)(yu)分(fen)離(li)(li)揮發性(xing)化(hua)合(he)物(wu)。GC根據固(gu)定相(xiang)(xiang)(xiang)不同又可分(fen)為(wei)(wei)氣(qi)固(gu)色(se)譜(pu)(pu)法(GSC)和(he)(he)氣(qi)液(ye)(ye)色(se)譜(pu)(pu)法(GLC)，其中以GLC應用(yong)(yong)(yong)(yong)zui廣。液(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法適用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)(yu)分(fen)離(li)(li)低揮發性(xing)或(huo)非(fei)揮發性(xing)、熱穩(wen)定性(xing)差的物(wu)質(zhi)。LC同樣可分(fen)為(wei)(wei)液(ye)(ye)固(gu)色(se)譜(pu)(pu)法(LSC)和(he)(he)液(ye)(ye)液(ye)(ye)色(se)譜(pu)(pu)法(LLC)。此外還有超(chao)臨界流體(ti)色(se)譜(pu)(pu)法(SFC)，它(ta)以超(chao)臨界流體(ti)(界于(yu)(yu)氣(qi)體(ti)和(he)(he)液(ye)(ye)體(ti)之間的一種物(wu)相(xiang)(xiang)(xiang))為(wei)(wei)流動相(xiang)(xiang)(xiang)(常用(yong)(yong)(yong)(yong)CO2)，因其擴散系數大，能很快(kuai)達到平衡，故(gu)分(fen)析時間短，特別適用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)(yu)手性(xing)化(hua)合(he)物(wu)的拆分(fen)。

　　按原理(li)分(fen)為吸附色(se)(se)譜(pu)(pu)法(fa)(AC)、分(fen)配(pei)色(se)(se)譜(pu)(pu)法(fa)(DC)、離子交(jiao)換色(se)(se)譜(pu)(pu)法(fa)(IEC)、排阻色(se)(se)譜(pu)(pu)法(fa)(EC，又稱(cheng)分(fen)子篩、凝(ning)膠過濾(GFC)、凝(ning)膠滲透色(se)(se)譜(pu)(pu)法(fa)(GPC)和(he)親(qin)和(he)色(se)(se)譜(pu)(pu)法(fa)。(此外還有(you)電泳。)

　　按(an)操作形式可(ke)分為紙色譜法(PC)、薄(bo)層色譜法(TLC)、柱色譜法。

　　四(si)、色譜分離(li)原(yuan)理(li)

　　液相色(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)按(an)分離機制的不同(tong)分為液固吸附色(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)、液液分配色(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)(正相與反(fan)相)、離子(zi)交換色(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)、離子(zi)對(dui)色(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)及(ji)分子(zi)排(pai)阻色(se)(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)。

　　1.液固色譜法　使用固體(ti)吸附劑，被分離(li)組(zu)分在色譜柱上分離(li)原(yuan)理是(shi)根據固定相對組(zu)分吸附力大(da)小(xiao)不同(tong)而(er)分離(li)。分離(li)過程(cheng)是(shi)一個(ge)吸附-解吸附的(de)平衡過程(cheng)。常用的(de)吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于(yu)(yu)分離(li)分子量200~1000的(de)組(zu)分，大(da)多(duo)數(shu)用于(yu)(yu)非離(li)子型化合物(wu)，離(li)子型化合物(wu)易(yi)產生拖尾(wei)。常用于(yu)(yu)分離(li)同(tong)分異構體(ti)。

　　2.液(ye)液(ye)色譜法　使用將特(te)定(ding)的(de)液(ye)態(tai)物質涂于(yu)擔(dan)(dan)體表(biao)面(mian)，或化學鍵合于(yu)擔(dan)(dan)體表(biao)面(mian)而形成的(de)固(gu)定(ding)相，分離(li)原(yuan)理(li)是根據被分離(li)的(de)組分在流動相和固(gu)定(ding)相中溶解度不同而分離(li)。分離(li)過程是一個分配(pei)平衡(heng)過程。

　　涂(tu)布式(shi)固(gu)(gu)(gu)定(ding)相(xiang)應具有(you)良(liang)好的(de)(de)惰性;流(liu)(liu)動相(xiang)必須預(yu)先用固(gu)(gu)(gu)定(ding)相(xiang)飽和(he)(he)，以減少固(gu)(gu)(gu)定(ding)相(xiang)從擔(dan)體表面流(liu)(liu)失;溫度的(de)(de)變(bian)化和(he)(he)不同批號流(liu)(liu)動相(xiang)的(de)(de)區別常引(yin)起(qi)柱子的(de)(de)變(bian)化;另外在流(liu)(liu)動相(xiang)中存(cun)在的(de)(de)固(gu)(gu)(gu)定(ding)相(xiang)也使(shi)樣品的(de)(de)分(fen)離和(he)(he)收集復雜化。由于涂(tu)布式(shi)固(gu)(gu)(gu)定(ding)相(xiang)很(hen)難避免固(gu)(gu)(gu)定(ding)液(ye)流(liu)(liu)失，現(xian)(xian)在已很(hen)少采用。現(xian)(xian)在多采用的(de)(de)是化學(xue)鍵合固(gu)(gu)(gu)定(ding)相(xiang)，如(ru)C18、C8、氨(an)基(ji)柱、氰基(ji)柱和(he)(he)苯基(ji)柱。

　　液(ye)液(ye)色譜(pu)法按固定相和流動相的極性不同可(ke)分為正相色譜(pu)法(NPC)和反(fan)相色譜(pu)法(RPC)。

　　正相(xiang)色譜法　采用極性固定相(xiang)(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合(he)相(xiang));流動相(xiang)為相(xiang)對非極性的(de)疏水性溶劑(烷烴類(lei)如正已(yi)烷、環已(yi)烷)，常加入乙醇、異(yi)丙醇、四(si)氫呋(fu)喃、三氯甲烷等(deng)以調節組(zu)分(fen)的(de)保留時間。常用于分(fen)離中(zhong)等(deng)極性和極性較強(qiang)的(de)化合(he)物(如酚類(lei)、胺(an)類(lei)、羰基類(lei)及氨基酸類(lei)等(deng))。

　　反相色譜(pu)法　一般用非(fei)極(ji)性固定相(如C18、C8);流動相為水(shui)或緩(huan)沖液(ye)，常加入甲醇、乙腈、異丙(bing)醇、丙(bing)酮、四氫(qing)呋喃等與水(shui)互溶(rong)的有機溶(rong)劑以(yi)調節保留(liu)時間。適用于分離非(fei)極(ji)性和極(ji)性較弱的化合物。RPC在現代(dai)液(ye)相色譜(pu)中應用，據(ju)統計，它占整(zheng)個HPLC應用的80%左(zuo)右(you)。

　　隨著柱(zhu)填料的(de)(de)(de)快速(su)發(fa)展，反相(xiang)色譜法的(de)(de)(de)應用(yong)(yong)范圍逐漸擴(kuo)大，現已(yi)應用(yong)(yong)于(yu)某些無機樣(yang)品或(huo)易解(jie)離樣(yang)品的(de)(de)(de)分析。為控制(zhi)樣(yang)品在分析過(guo)程的(de)(de)(de)解(jie)離，常用(yong)(yong)緩沖液控制(zhi)流動(dong)相(xiang)的(de)(de)(de)pH值(zhi)(zhi)。但需(xu)要注意(yi)的(de)(de)(de)是(shi)，C18和C8使用(yong)(yong)的(de)(de)(de)pH值(zhi)(zhi)通常為2.5~7.5(2~8)，太(tai)高(gao)的(de)(de)(de)pH值(zhi)(zhi)會(hui)使硅(gui)膠(jiao)溶(rong)解(jie)，太(tai)低的(de)(de)(de)pH值(zhi)(zhi)會(hui)使鍵合的(de)(de)(de)烷(wan)基脫落。有(you)報告(gao)新商品柱(zhu)可在pH 1.5~10范圍操作。

　　正(zheng)相色譜法與反(fan)相色譜法比較表

　　正(zheng)相色(se)譜(pu)法 反相色(se)譜(pu)法

　　固(gu)定相(xiang)極性(xing) 高～中(zhong) 中(zhong)～低(di)

　　流動相(xiang)極性 低～中 中～高

　　組(zu)分(fen)洗脫次序 極性(xing)(xing)小先洗出(chu) 極性(xing)(xing)大(da)先洗出(chu)

　　從上表可看(kan)出，當極性為(wei)中(zhong)等時正相色(se)譜法與反相色(se)譜法沒有明顯(xian)的界線(如氨(an)基(ji)鍵(jian)合固(gu)定相)。

　　3.離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)色譜(pu)法　固(gu)定相(xiang)是離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)樹(shu)(shu)脂，常用苯乙(yi)烯(xi)與(yu)二乙(yi)烯(xi)交聯形成的(de)聚合物骨架，在表面(mian)未端芳環上(shang)(shang)接上(shang)(shang)羧基(ji)、磺酸基(ji)(稱(cheng)陽離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)樹(shu)(shu)脂)或季氨基(ji)(陰離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)樹(shu)(shu)脂)。被(bei)分(fen)(fen)離(li)(li)組分(fen)(fen)在色譜(pu)柱上(shang)(shang)分(fen)(fen)離(li)(li)原理是樹(shu)(shu)脂上(shang)(shang)可電離(li)(li)離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)與(yu)流動(dong)相(xiang)中具有相(xiang)同電荷(he)(he)的(de)離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)及(ji)被(bei)測(ce)組分(fen)(fen)的(de)離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)進行(xing)可逆交換(huan)，根(gen)據各離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)與(yu)離(li)(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)基(ji)團具有不同的(de)電荷(he)(he)吸(xi)引力(li)而分(fen)(fen)離(li)(li)。

　　緩沖(chong)液常用(yong)(yong)作離(li)(li)子交(jiao)換色譜的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)。被分(fen)(fen)離(li)(li)組分(fen)(fen)在離(li)(li)子交(jiao)換柱(zhu)中的(de)保留時(shi)間除跟組分(fen)(fen)離(li)(li)子與樹脂上的(de)離(li)(li)子交(jiao)換基(ji)團作用(yong)(yong)強弱有關外，它還受流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)pH值和離(li)(li)子強度(du)影響。pH值可改變化(hua)合物(wu)的(de)解離(li)(li)程度(du)，進而影響其與固定相(xiang)的(de)作用(yong)(yong)。流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)鹽濃度(du)大，則離(li)(li)子強度(du)高，不利于樣(yang)品(pin)的(de)解離(li)(li)，導致樣(yang)品(pin)較快流(liu)出(chu)。

　　離子交換色譜法主要用于分(fen)析有機酸、氨基(ji)酸、多肽及核酸。

　　4.離子對色譜法　又(you)稱偶離子色譜法，是液(ye)液(ye)色譜法的(de)(de)分(fen)支。它是根據被測組分(fen)離子與離子對試劑離子形成中(zhong)性的(de)(de)離子對化合物后，在非(fei)極(ji)性固定(ding)相(xiang)中(zhong)溶解度增大，從而使其(qi)分(fen)離效果改善。主(zhu)要用于分(fen)析離子強度大的(de)(de)酸堿物質。

　　分析堿性物質常用的離(li)子(zi)對試(shi)劑為(wei)烷(wan)基(ji)磺酸(suan)鹽，如(ru)戊烷(wan)磺酸(suan)鈉(na)、辛烷(wan)磺酸(suan)鈉(na)等。另(ling)外(wai)高氯酸(suan)、可(ke)與多(duo)種堿性樣品形成很強的離(li)子(zi)對。

　　分析酸性物(wu)質(zhi)常用四(si)丁基季(ji)銨(an)(an)鹽，如四(si)丁基溴化銨(an)(an)、四(si)丁基銨(an)(an)磷酸鹽。

　　離(li)子(zi)(zi)對(dui)(dui)色譜法常用ODS柱(即C18)，流動相為甲醇(chun)-水(shui)或乙腈-水(shui)，水(shui)中加入(ru)3~10 mmol/L的離(li)子(zi)(zi)對(dui)(dui)試劑，在(zai)一(yi)定的pH值范圍內進行分離(li)。被測(ce)組(zu)(zu)分保時間與離(li)子(zi)(zi)對(dui)(dui)性質、濃度、流動相組(zu)(zu)成及(ji)其pH值、離(li)子(zi)(zi)強度有關。

　　5.排(pai)阻色(se)譜法　固定相(xiang)是(shi)有一定孔徑的多(duo)孔性(xing)填料，流(liu)動相(xiang)是(shi)可以溶解樣(yang)品的溶劑(ji)。小(xiao)分(fen)子(zi)量的化合(he)(he)物可以進入(ru)孔中(zhong)，滯(zhi)留時間長;大(da)(da)分(fen)子(zi)量的化合(he)(he)物不能(neng)進入(ru)孔中(zhong)，直接隨流(liu)動相(xiang)流(liu)出。它利用(yong)分(fen)子(zi)篩對分(fen)子(zi)量大(da)(da)小(xiao)不同的各組(zu)分(fen)排(pai)阻能(neng)力的差(cha)異而完成分(fen)離(li)。常用(yong)于分(fen)離(li)高分(fen)子(zi)化合(he)(he)物，如組(zu)織提(ti)取物、多(duo)肽(tai)、蛋(dan)白質、核(he)酸等。

　　被(bei)分離(li)組分在柱中的洗脫(tuo)原理

　　II.基(ji)本概念和理論(lun)

　　一、基(ji)本概念和術(shu)語

　　1.色(se)譜圖和峰(feng)參數(shu)

　　色譜(pu)圖(chromatogram)——樣品流(liu)經色譜(pu)柱(zhu)和檢(jian)測(ce)器(qi)，所得到的信號(hao)-時(shi)間曲線，又(you)稱色譜(pu)流(liu)出曲線(elution profile)。

　　基線(xian)(base line)——經(jing)流(liu)(liu)動(dong)相沖洗，柱與流(liu)(liu)動(dong)相達到(dao)平(ping)衡后，檢測器測出一段(duan)時間(jian)的流(liu)(liu)出曲(qu)線(xian)。一般(ban)應平(ping)行于時間(jian)軸。

　　噪音(noise)——基線信號的波動(dong)。通常因電(dian)源接觸(chu)不(bu)良(liang)或瞬(shun)時過載、檢測(ce)器(qi)不(bu)穩定(ding)、流動(dong)相含有氣泡或色譜柱被污染所致(zhi)。

　　漂移(drift)——基(ji)線隨時間的(de)緩緩變(bian)化。主要由于操作條件如(ru)電壓、溫度、流動相及流量的(de)不穩定所引起，柱內的(de)污染物(wu)或固定相不斷被洗脫下來也會(hui)產生漂移。

　　色譜(pu)峰(feng)(peak)——組分(fen)流經(jing)檢測器時響(xiang)應的(de)連續信號(hao)產生(sheng)的(de)曲(qu)線。流出曲(qu)線上的(de)突起部分(fen)。正常色譜(pu)峰(feng)近似(si)于對稱形(xing)正態分(fen)布曲(qu)線(高斯Gauss曲(qu)線)。不對稱色譜(pu)峰(feng)有(you)兩種：前(qian)延峰(feng)(leading peak)和拖尾峰(feng)(tailing peak)。前(qian)者少見。

　　拖(tuo)尾(wei)因子(zi)(zi)(tailing factor，T)——T=，用以衡量色譜(pu)峰的對(dui)稱(cheng)性。也稱(cheng)為(wei)(wei)(wei)對(dui)稱(cheng)因子(zi)(zi)(symmetry factor)或不(bu)對(dui)稱(cheng)因子(zi)(zi)(asymmetry factor)。《中國藥典》規(gui)定T應為(wei)(wei)(wei)0.95~1.05。T<0.95為(wei)(wei)(wei)前延峰，T>1.05為(wei)(wei)(wei)拖(tuo)尾(wei)峰。

　　峰底(di)—基(ji)線(xian)上(shang)峰的起(qi)點(dian)至(zhi)終點(dian)的距(ju)離。

　　峰高(gao)(peak height，h)—峰的zui高(gao)點至(zhi)峰底(di)的距離。

　　峰(feng)寬(peak width，W)—峰(feng)兩(liang)側(ce)拐點處所作兩(liang)條切(qie)線與基線的兩(liang)個交點間的距離。W=4σ

　　半(ban)峰寬(kuan)(peak width at half-height，Wh/2)—峰高(gao)一半(ban)處的峰寬(kuan)。Wh/2=2.355σ

　　標準(zhun)偏(pian)差(standard deviation，σ)—正態(tai)分布曲線x=±1時(shi)(拐點)的峰(feng)(feng)(feng)寬之半(ban)。正常峰(feng)(feng)(feng)的拐點在峰(feng)(feng)(feng)高的0.607倍處。標準(zhun)偏(pian)差的大小(xiao)說(shuo)明組分在流出(chu)色譜(pu)柱(zhu)過程(cheng)中的分散程(cheng)度。σ小(xiao)，分散程(cheng)度小(xiao)、極點濃度高、峰(feng)(feng)(feng)形瘦、柱(zhu)效高;反之，σ大，峰(feng)(feng)(feng)形胖、柱(zhu)效低。

　　峰面積(peak area，A)—峰與峰底所包(bao)圍的(de)面積。A=×σ×h=2.507σh=1.064 Wh/2h

　　2.定性參數(保留值)

　　死時間(jian)(jian)(dead time，t0)——不(bu)保(bao)(bao)留組分(fen)的保(bao)(bao)留時間(jian)(jian)。即流動相(溶(rong)劑)通過色譜柱(zhu)的時間(jian)(jian)。在反相HPLC中可(ke)用苯磺酸鈉來測定死時間(jian)(jian)。

　　死體積(dead volume，V0)——由進樣器進樣口(kou)到(dao)檢測(ce)器流動池未被固定相(xiang)(xiang)所占據的(de)空間。它包括4部分(fen)：進樣器至色(se)譜柱(zhu)管(guan)路(lu)體積、柱(zhu)內固定相(xiang)(xiang)顆粒間隙(被流動相(xiang)(xiang)占據，Vm)、柱(zhu)出口(kou)管(guan)路(lu)體積、檢測(ce)器流動池體積。其中只(zhi)有Vm參與色(se)譜平衡過程，其它3部分(fen)只(zhi)起峰擴展作用。為(wei)防止峰擴展，這3部分(fen)體積應(ying)盡(jin)量減小。V0=F×t0(F為(wei)流速(su))

　　保留時間(jian)(retention time，tR)——從進樣開始(shi)到某個組分在柱后出現濃度極大值的(de)時間(jian)。

　　保留體(ti)積(ji)(retention volume，VR)——從進(jin)樣開始(shi)到某組分在柱后出(chu)現濃度極大(da)值時流出(chu)溶劑的體(ti)積(ji)。又稱洗脫體(ti)積(ji)。VR=F×tR

　　調(diao)整(zheng)保留(liu)時(shi)(shi)間(jian)(adjusted retention結構time，t'R)——扣(kou)除死時(shi)(shi)間(jian)后(hou)的(de)保留(liu)時(shi)(shi)間(jian)。也稱折(zhe)合保留(liu)時(shi)(shi)間(jian)(reduced retention time)。在實驗條件(jian)(溫(wen)度(du)、固定(ding)相等)一定(ding)時(shi)(shi)，t'R只(zhi)決定(ding)于(yu)組分的(de)性質，因此，t'R(或tR)可用(yong)于(yu)定(ding)性。t'R=tR-t0

　　調整保留(liu)體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留(liu)體積。V'R=VR-V0或V'R=F×t'R

　　3.柱效參數

　　理論塔板數(shu)(theoretical plate number，N)—&mdash;用于定量表(biao)示色譜(pu)柱的分離效(xiao)率(簡稱柱效(xiao))。

　　N取決于固定(ding)相(xiang)的(de)種(zhong)類(lei)、性質(粒度、粒徑分布(bu)等)、填充狀況(kuang)、柱(zhu)長、流動相(xiang)的(de)種(zhong)類(lei)和(he)流速(su)及測定(ding)柱(zhu)效所用物質的(de)性質。如果峰形(xing)對稱(cheng)并符合(he)正態分布(bu)，N可近似表示為：N=()2=16()2=5.54()2

　　N為常(chang)量時，W隨tR成正比例變化。在一(yi)張多組分色譜圖上，如果各(ge)組分含量相當，則(ze)后洗脫的(de)峰比前面的(de)峰要逐漸(jian)加(jia)寬(kuan)，峰高則(ze)逐漸(jian)降(jiang)低。

　　用(yong)半峰(feng)(feng)寬(kuan)計算(suan)理(li)論塔數比用(yong)峰(feng)(feng)寬(kuan)計算(suan)更(geng)為方便和(he)常用(yong)，因(yin)為半峰(feng)(feng)寬(kuan)更(geng)易準確測(ce)定，尤其是對稍有拖尾(wei)的峰(feng)(feng)。

　　N與柱(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)長(chang)(chang)(chang)(chang)成正比，柱(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)越長(chang)(chang)(chang)(chang)，N越大。用N表(biao)示(shi)(shi)柱(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)效時(shi)應(ying)注明(ming)柱(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)長(chang)(chang)(chang)(chang)，如果未注明(ming)，則表(biao)示(shi)(shi)柱(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)長(chang)(chang)(chang)(chang)為1米時(shi)的理論塔(ta)板數(shu)。(一般HPLC柱(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)的N在1000以上。)

　　若用調(diao)整保留(liu)時(shi)間(t'R)計算理論(lun)塔(ta)板數(shu)，所得值稱為(wei)有效理論(lun)塔(ta)板數(shu)(N有效或Neff)。

　　理(li)(li)論(lun)塔(ta)板高度(theoretical plate height，H)&mdash;—每(mei)單位柱長的方差。H=。實際應(ying)用時(shi)往往用柱長L和理(li)(li)論(lun)塔(ta)板數計(ji)算：H=，H有(you)效=。

　　4.相平衡參數

　　分配(pei)系(xi)數(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相(xiang)間達到分配(pei)平衡(heng)時，在固定相(xiang)與流動(dong)相(xiang)中的濃度之(zhi)比。K=。

　　分配系數(shu)(shu)與組(zu)分、流動相和(he)固定相的熱力學性質有關，也(ye)與溫度、壓力有關。在(zai)不(bu)同的色(se)譜(pu)分離(li)機制(zhi)中，K有不(bu)同的概念：吸附色(se)譜(pu)法為吸附系數(shu)(shu)，離(li)子交(jiao)換色(se)譜(pu)法為選(xuan)擇性系數(shu)(shu)(或稱交(jiao)換系數(shu)(shu))，凝膠色(se)譜(pu)法為滲透(tou)參數(shu)(shu)。但一(yi)般(ban)情況可(ke)用分配系數(shu)(shu)來表示。

　　在(zai)條件(流(liu)動(dong)相(xiang)、固定相(xiang)、溫度和壓力等)一(yi)定，樣品濃度很(hen)(hen)低時(shi)(Cs、Cm很(hen)(hen)小(xiao))時(shi)，K只取決于組分(fen)的(de)性質(zhi)，而與濃度無關。這只是理想狀(zhuang)態下(xia)的(de)色譜條件，在(zai)這種條件下(xia)，得(de)到的(de)色譜峰(feng)(feng)(feng)為正常峰(feng)(feng)(feng);在(zai)許多情況下(xia)，隨(sui)(sui)著(zhu)(zhu)濃度的(de)增大，K減小(xiao)，這時(shi)色譜峰(feng)(feng)(feng)為拖尾(wei)峰(feng)(feng)(feng);而有時(shi)隨(sui)(sui)著(zhu)(zhu)溶質(zhi)濃度增大，K也(ye)增大，這時(shi)色譜峰(feng)(feng)(feng)為前延峰(feng)(feng)(feng)。因(yin)此，只有盡可能減少進樣量，使組分(fen)在(zai)柱(zhu)內濃度降(jiang)低，K恒定時(shi)，才(cai)能獲得(de)正常峰(feng)(feng)(feng)。

　　在同一(yi)色(se)譜(pu)條件下(xia)，樣品中(zhong)(zhong)K值(zhi)(zhi)大的(de)(de)組分在固定(ding)相中(zhong)(zhong)滯留時間(jian)長，后流(liu)出色(se)譜(pu)柱;K值(zhi)(zhi)小(xiao)的(de)(de)組分則滯留時間(jian)短，先流(liu)出色(se)譜(pu)柱。混合(he)物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)各組分的(de)(de)分配系(xi)數相差越大，越容(rong)易分離，因此混合(he)物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)各組分的(de)(de)分配系(xi)數不同是色(se)譜(pu)分離的(de)(de)前提。

　　在HPLC中，固定相(xiang)確定后，K主要(yao)(yao)受流(liu)動相(xiang)的(de)(de)性質(zhi)影響。實踐中主要(yao)(yao)靠調整流(liu)動相(xiang)的(de)(de)組成(cheng)配(pei)比及pH值，以獲得組分(fen)(fen)間的(de)(de)分(fen)(fen)配(pei)系數差異及適宜的(de)(de)保留時間，達到分(fen)(fen)離(li)的(de)(de)目的(de)(de)。

　　容量因(yin)(yin)子(capacity factor，k)——化合物(wu)在(zai)兩相間達(da)到分配平(ping)衡時，在(zai)固(gu)定相與流動相中的量之比。k=。因(yin)(yin)此容量因(yin)(yin)子也稱質量分配系數(shu)。

　　分配(pei)系(xi)數、容量因子與保(bao)留(liu)時(shi)(shi)間(jian)之間(jian)有(you)如下(xia)關(guan)系(xi)：k===K=，t'R=k t0。上式說(shuo)明容量因子的(de)(de)物理意義：表示一個組分在固定相中停(ting)留(liu)的(de)(de)時(shi)(shi)間(jian)(t'R)是不保(bao)留(liu)組分保(bao)留(liu)時(shi)(shi)間(jian)(t0)的(de)(de)幾倍(bei)。k=0時(shi)(shi)，化合物全(quan)部存在于流動相中，在固定相中不保(bao)留(liu)，t'R=0;k越(yue)大，說(shuo)明固定相對此組分的(de)(de)容量越(yue)大，出柱(zhu)慢，保(bao)留(liu)時(shi)(shi)間(jian)越(yue)長。

　　容(rong)量因(yin)子與(yu)分(fen)配系(xi)數的(de)不同(tong)點是：K取(qu)決于(yu)組分(fen)、流動相、固定(ding)相的(de)性質及(ji)溫(wen)度，而與(yu)體(ti)積Vs、Vm無關(guan);k除了與(yu)性質及(ji)溫(wen)度有關(guan)外，還與(yu)Vs、Vm有關(guan)。由于(yu)t'R、t0較(jiao)Vs、Vm易于(yu)測定(ding)，所(suo)以容(rong)量因(yin)子比分(fen)配系(xi)數應用更(geng)廣泛(fan)。

　　選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系(xi)數或容量因子之比。α==(設k2>k1)。因k=t'R/t0，則α=，所以α又稱為(wei)相對保留時(shi)間(《美國(guo)藥典》)。

　　要使兩(liang)組(zu)分得到(dao)分離，必須使α≠1。α與化合物(wu)在固定相(xiang)和流動相(xiang)中(zhong)的(de)分配(pei)性質(zhi)、柱(zhu)(zhu)溫(wen)有關，與柱(zhu)(zhu)尺寸、流速、填充情況(kuang)無關。從本質(zhi)上(shang)來說，α的(de)大小表示兩(liang)組(zu)分在兩(liang)相(xiang)間的(de)平衡(heng)分配(pei)熱力學性質(zhi)的(de)差(cha)異，即分子間相(xiang)互作用力的(de)差(cha)異。

　　5.分離參數

　　分(fen)(fen)(fen)(fen)離度(resolution，R)——相鄰兩峰(feng)(feng)的保留時(shi)間(jian)之差與平均峰(feng)(feng)寬的比值(zhi)。也叫分(fen)(fen)(fen)(fen)辨率，表示相鄰兩峰(feng)(feng)的分(fen)(fen)(fen)(fen)離程度。R=。當W1=W2時(shi)，R=。當R=1時(shi)，稱(cheng)為4σ分(fen)(fen)(fen)(fen)離，兩峰(feng)(feng)基(ji)本分(fen)(fen)(fen)(fen)離，裸露峰(feng)(feng)面積為95.4%，內側峰(feng)(feng)基(ji)重疊約2%。R=1.5時(shi)，稱(cheng)為6σ分(fen)(fen)(fen)(fen)離，裸露峰(feng)(feng)面積為99.7%。R≥1.5稱(cheng)為*分(fen)(fen)(fen)(fen)離。

　　《中國藥典》規定R應(ying)大于1.5。

　　基(ji)本分離方程——分離度(du)與三個色譜基(ji)本參(can)數(shu)有(you)如下(xia)關系:

　　R=××

　　其(qi)中稱為柱(zhu)效項，為柱(zhu)選擇性(xing)項，為柱(zhu)容量(liang)項。柱(zhu)效項與色譜(pu)過程動(dong)力學(xue)特性(xing)有關(guan)，后兩項與色譜(pu)過程熱力學(xue)因(yin)素(su)有關(guan)。

　　從基本分(fen)(fen)離(li)(li)方(fang)程(cheng)可(ke)(ke)看(kan)出，提(ti)高分(fen)(fen)離(li)(li)度(du)(du)有三種途(tu)徑(jing)：①增(zeng)(zeng)(zeng)加(jia)塔(ta)板數。方(fang)法(fa)之一(yi)是增(zeng)(zeng)(zeng)加(jia)柱(zhu)長(chang)(chang)，但這樣會(hui)延(yan)(yan)長(chang)(chang)保留時(shi)間、增(zeng)(zeng)(zeng)加(jia)柱(zhu)壓。更好的方(fang)法(fa)是降低塔(ta)板高度(du)(du)，提(ti)高柱(zhu)效。②增(zeng)(zeng)(zeng)加(jia)選(xuan)擇性。當α=1時(shi)，R=0，無論柱(zhu)效有多高，組分(fen)(fen)也不(bu)可(ke)(ke)能分(fen)(fen)離(li)(li)。一(yi)般可(ke)(ke)以采取以下(xia)措(cuo)施來改變(bian)(bian)(bian)選(xuan)擇性：a. 改變(bian)(bian)(bian)流動(dong)相的組成及pH值;b. 改變(bian)(bian)(bian)柱(zhu)溫;c. 改變(bian)(bian)(bian)固定(ding)相。③改變(bian)(bian)(bian)容量因子(zi)。這常常是提(ti)高分(fen)(fen)離(li)(li)度(du)(du)的zui容易方(fang)法(fa)，可(ke)(ke)以通過調節流動(dong)相的組成來實現(xian)。k2趨(qu)于(yu)0時(shi)，R也趨(qu)于(yu)0;k2增(zeng)(zeng)(zeng)大，R也增(zeng)(zeng)(zeng)大。但k2不(bu)能太大，否則不(bu)但分(fen)(fen)離(li)(li)時(shi)間延(yan)(yan)長(chang)(chang)，而且(qie)峰形變(bian)(bian)(bian)寬，會(hui)影(ying)響(xiang)分(fen)(fen)離(li)(li)度(du)(du)和檢測靈敏度(du)(du)。一(yi)般k2在1~10范圍內，為(wei)2~5，窄徑(jing)柱(zhu)可(ke)(ke)更小些。

　　二、塔板理論

　　1.塔(ta)板理(li)論的基本假設

　　塔(ta)(ta)板(ban)理(li)論是(shi)Martin和(he)Synger首先(xian)提出的(de)色譜(pu)熱力學平衡理(li)論。它把色譜(pu)柱看作分(fen)(fen)餾塔(ta)(ta)，把組分(fen)(fen)在(zai)(zai)色譜(pu)柱內(nei)(nei)的(de)分(fen)(fen)離過程(cheng)看成(cheng)在(zai)(zai)分(fen)(fen)餾塔(ta)(ta)中(zhong)的(de)分(fen)(fen)餾過程(cheng)，即組分(fen)(fen)在(zai)(zai)塔(ta)(ta)板(ban)間(jian)隔內(nei)(nei)的(de)分(fen)(fen)配平衡過程(cheng)。塔(ta)(ta)板(ban)理(li)論的(de)基本假(jia)設為(wei)：

　　1) 色譜柱內存在(zai)許多塔(ta)(ta)板，組分在(zai)塔(ta)(ta)板間隔(即塔(ta)(ta)板高度)內*服(fu)從分配定律，并(bing)很快達(da)到分配平衡(heng)。

　　2) 樣(yang)品(pin)加在第0號塔板上，樣(yang)品(pin)沿色(se)譜柱軸方(fang)向的擴散可(ke)以忽略。

　　3) 流動(dong)相在色譜柱內間(jian)歇式流動(dong)，每(mei)次(ci)進入一個塔板體(ti)積。

　　4) 在(zai)所有塔(ta)板(ban)上分配系數相等，與(yu)組分的量無關(guan)。

　　雖然以(yi)上假設與(yu)實際色(se)譜(pu)過(guo)程(cheng)不(bu)符，如色(se)譜(pu)過(guo)程(cheng)是一個動態(tai)過(guo)程(cheng)，很難達到分配平衡(heng);組分沿(yan)色(se)譜(pu)柱(zhu)軸方向(xiang)的擴散是不(bu)可避免的。但是塔板(ban)理論(lun)導出了色(se)譜(pu)流出曲線方程(cheng)，成功地解釋了流出曲線的形(xing)狀、濃(nong)度極大(da)點(dian)的位置，能(neng)夠(gou)評價色(se)譜(pu)柱(zhu)柱(zhu)效。

　　2.色譜流出(chu)曲線方(fang)程及(ji)定量參數(峰高h和峰面積A)

　　根據(ju)塔板理(li)論，流出曲線可用(yong)下述正(zheng)態(tai)分布方程來描述：C=e或C=e

　　由色(se)譜流出曲線方(fang)程可知：當t=tR時(shi)，濃度C有極大值(zhi)，Cmax=。Cmax就是色(se)譜峰(feng)的(de)峰(feng)高(gao)。因此上(shang)式說明：①當實(shi)驗(yan)條件一(yi)定時(shi)(即σ一(yi)定)，峰(feng)高(gao)h與組分的(de)量(liang)C0(進樣量(liang))成正(zheng)比，所(suo)以正(zheng)常峰(feng)的(de)峰(feng)高(gao)可用于定量(liang)分析(xi)。②當進樣量(liang)一(yi)定時(shi)，σ越小(柱效(xiao)越高(gao))，峰(feng)高(gao)越高(gao)，因此提(ti)高(gao)柱效(xiao)能提(ti)高(gao)HPLC分析(xi)的(de)靈(ling)敏度。

　　由流出(chu)曲線(xian)方程對V(0~∞)求積分(fen)(fen)，即(ji)得(de)出(chu)色譜峰面積A=×σ×Cmax=C0。可(ke)見A相當于(yu)組分(fen)(fen)進樣量C0，因(yin)此是常用的(de)定量參數。把(ba)Cmax=h和Wh/2=2.355σ代入(ru)上(shang)式，即(ji)得(de)A=1.064×Wh/2&times;h，此為正常峰的(de)峰面積計算(suan)公式。

　　三、速率理(li)論(lun)(又稱隨機模型理(li)論(lun))

　　1.液相色譜速率方程

　　1956年(nian)荷(he)蘭學者Van Deemter等(deng)人吸收了塔板理(li)論(lun)的(de)(de)(de)概念，并把影響塔板高度的(de)(de)(de)動(dong)力學因素(su)結合起來，提(ti)出(chu)了色譜過(guo)(guo)程的(de)(de)(de)動(dong)力學理(li)論(lun)——速率理(li)論(lun)。它把色譜過(guo)(guo)程看作(zuo)一(yi)個(ge)動(dong)態(tai)非(fei)平衡過(guo)(guo)程，研究過(guo)(guo)程中的(de)(de)(de)動(dong)力學因素(su)對峰展寬(即(ji)柱效)的(de)(de)(de)影響。

　　后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方(fang)程(cheng)(H=A+B/u+Cu，后稱氣(qi)相(xiang)色譜速(su)率(lv)方(fang)程(cheng))的(de)基(ji)礎上，根據液體(ti)與氣(qi)體(ti)的(de)性質差異，提出了液相(xiang)色譜速(su)率(lv)方(fang)程(cheng)(即Giddings方(fang)程(cheng))：H=2λdp++\s\up5(2p+\s\up5(2p+\s\up5(2f

　　2.影響柱效的因素

　　1)渦流擴散(eddy diffusion)。由于(yu)色譜柱內填(tian)充劑的(de)幾何結構不(bu)同(tong)，分(fen)子(zi)(zi)在色譜柱中(zhong)的(de)流速不(bu)同(tong)而引(yin)起的(de)峰展寬(kuan)。渦流擴散項(xiang)A=2λdp，dp為填(tian)料直徑，λ為填(tian)充不(bu)規則因子(zi)(zi)，填(tian)充越(yue)不(bu)均勻λ越(yue)大(da)。HPLC常用填(tian)料粒(li)度(du)一般為3~10μm，3~5μm，粒(li)度(du)分(fen)布(bu)RSD≤5%。但粒(li)度(du)太(tai)小難于(yu)填(tian)充均勻(λ大(da))，且會(hui)使柱壓過高。大(da)而均勻(球(qiu)形或近(jin)球(qiu)形)的(de)顆粒(li)容易填(tian)充規則均勻，λ越(yue)小。總的(de)說來，應(ying)采(cai)用細而均勻的(de)載體，這樣有助(zhu)于(yu)提高柱效(xiao)。毛細管無填(tian)料，A=0。

　　2)分(fen)(fen)子(zi)擴散(san)(san)(molecular diffusion)。又稱縱向擴散(san)(san)。由(you)(you)于進樣后溶質分(fen)(fen)子(zi)在(zai)(zai)柱(zhu)內存(cun)在(zai)(zai)濃度(du)(du)梯度(du)(du)，導致軸向擴散(san)(san)而(er)引(yin)起(qi)的(de)(de)(de)峰(feng)展寬。分(fen)(fen)子(zi)擴散(san)(san)項B/u=2γDm/u。u為(wei)流(liu)動相線速度(du)(du)，分(fen)(fen)子(zi)在(zai)(zai)柱(zhu)內的(de)(de)(de)滯留時間越長(u小(xiao))，展寬越嚴(yan)重。在(zai)(zai)低(di)流(liu)速時，它對峰(feng)形的(de)(de)(de)影響較大。Dm為(wei)分(fen)(fen)子(zi)在(zai)(zai)流(liu)動相中的(de)(de)(de)擴散(san)(san)系數，由(you)(you)于液相的(de)(de)(de)Dm很小(xiao)，通常僅為(wei)氣相的(de)(de)(de)10-4~10-5，因此在(zai)(zai)HPLC中，只要流(liu)速不太低(di)的(de)(de)(de)話，這一(yi)項可以忽略不計。&gamma;是考慮到(dao)填料的(de)(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)使溶質分(fen)(fen)子(zi)不能自由(you)(you)地軸向擴散(san)(san)，而(er)引(yin)入的(de)(de)(de)柱(zhu)參數，用以對Dm進行校正。γ一(yi)般(ban)在(zai)(zai)0.6~0.7左右，毛(mao)細管(guan)柱(zhu)的(de)(de)(de)γ=1。

　　3)傳(chuan)質阻抗(mass transfer resistance)。由于溶質分子在(zai)流(liu)(liu)動(dong)相、靜(jing)態(tai)流(liu)(liu)動(dong)相和固(gu)定(ding)相中的(de)傳(chuan)質過(guo)程而導致的(de)峰展寬(kuan)。溶質分子在(zai)流(liu)(liu)動(dong)相和固(gu)定(ding)相中的(de)擴(kuo)散、分配、轉移的(de)過(guo)程并不是(shi)瞬間(jian)達到平(ping)衡(heng)，實際(ji)傳(chuan)質速度是(shi)有限的(de)，這一時間(jian)上(shang)的(de)滯(zhi)后(hou)使色(se)(se)譜(pu)柱總是(shi)在(zai)非平(ping)衡(heng)狀態(tai)下(xia)工(gong)作，從而產生峰展寬(kuan)。液相色(se)(se)譜(pu)的(de)傳(chuan)質阻抗項(xiang)(xiang)Cu又分為三項(xiang)(xiang)。

　　①流(liu)(liu)動相(xiang)傳質(zhi)阻抗Hm=Cmd2pu/Dm，Cm為常數(shu)。這是(shi)由(you)于在一個流(liu)(liu)路中流(liu)(liu)路中心和(he)邊(bian)緣的(de)流(liu)(liu)速不等所致。靠近填充顆粒(li)的(de)流(liu)(liu)動相(xiang)流(liu)(liu)速較(jiao)慢(man)，而中心較(jiao)快，處于中心的(de)分子(zi)還(huan)未來(lai)得及與(yu)固定相(xiang)達到(dao)分配平衡就隨流(liu)(liu)動相(xiang)前移，因而產生峰展寬(kuan)。

　　②靜態(tai)流(liu)動(dong)相(xiang)傳(chuan)質(zhi)阻抗(kang)Hsm=Csmd2pu/Dm，Csm為常數。這是由于溶質(zhi)分子進入處于固定相(xiang)孔穴內的(de)靜止(zhi)流(liu)動(dong)相(xiang)中，晚回到流(liu)路中而引起峰(feng)(feng)展寬。Hsm對峰(feng)(feng)展寬的(de)影響在整個傳(chuan)質(zhi)過程中起著主要作(zuo)用(yong)。固定相(xiang)的(de)顆(ke)粒越(yue)(yue)小，微孔孔徑(jing)越(yue)(yue)大，傳(chuan)質(zhi)阻力就越(yue)(yue)小，傳(chuan)質(zhi)速率越(yue)(yue)高。所以(yi)改進固定相(xiang)結構，減小靜態(tai)流(liu)動(dong)相(xiang)傳(chuan)質(zhi)阻力，是提高液相(xiang)色譜(pu)柱效(xiao)的(de)關鍵。

　　Hm和Hsm都與固定(ding)相的粒(li)徑平方d2p 成(cheng)正(zheng)比(bi)，與擴散系(xi)數Dm成(cheng)反(fan)比(bi)。因此(ci)應采用低(di)粒(li)度固定(ding)相和低(di)粘度流動相。高柱溫可以增大(da)Dm，但(dan)用有機溶劑作流動相時，易產(chan)生氣泡，因此(ci)一般(ban)采用室溫。

　　③固(gu)定相傳質阻抗Hs=Csd2fu/Ds(液液分配(pei)色譜)，Cs為常數，df為固(gu)定液的(de)(de)液膜(mo)厚度，Ds為分子(zi)在(zai)固(gu)定液中(zhong)的(de)(de)擴散(san)系(xi)數。在(zai)分配(pei)色譜中(zhong)Hs與(yu)df的(de)(de)平方成正比，在(zai)吸(xi)(xi)附色譜中(zhong)Hs與(yu)吸(xi)(xi)附和解(jie)(jie)吸(xi)(xi)速(su)度成反比。因此只有在(zai)厚涂層固(gu)定液、深孔離(li)子(zi)交換(huan)樹(shu)脂或解(jie)(jie)吸(xi)(xi)速(su)度慢的(de)(de)吸(xi)(xi)附色譜中(zhong)，Hs才有明顯(xian)影響(xiang)。采(cai)用單分子(zi)層的(de)(de)化學鍵(jian)合固(gu)定相時Hs可以(yi)忽略。

　　從速率(lv)方程式(shi)可以(yi)看出，要(yao)獲得(de)能的(de)色(se)譜分析，一般可采(cai)用以(yi)下(xia)措施：①進樣時(shi)(shi)間要(yao)短。②填料粒(li)度要(yao)小(xiao)。③改善傳質(zhi)過程。過高(gao)的(de)吸(xi)附作用力可導致嚴重的(de)峰展(zhan)寬和拖尾，甚至不(bu)可逆(ni)吸(xi)附。④適當(dang)的(de)流(liu)速。以(yi)H對u作圖，則有一*線(xian)速度uopt，在此線(xian)速度時(shi)(shi)，Hzui小(xiao)。一般在液相色(se)譜中(zhong)，uopt很小(xiao)(大約(yue)0.03~